甜菊糖苷是从甜叶菊中提取的一类天然甜味剂，根据其侧链上葡萄糖基位置和个数的不同，可分为甜茶苷、甜菊苷、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷C等60余种类型。这些化合物都具有很高的甜度，但没有热量和升血糖作用，因此被认为是一种理想的天然甜味剂。目前已经发现了至少十几种不同类型的甜菊糖苷，其中最主要的有四种：莱鲍迪苷A（rebaudioside A）、莱鲍迪苷C（rebaudioside C）、斯特维苷（stevioside）和杜氏苷（dulcoside）。这些不同类型的甜菊糖苷在结构上主要是在基本单元——葡萄糖基化后形成不同数量和位置上连接在一起而形成。

它是其中最重要也最高端的一种产品，它是由四个葡萄糖分子与一个甜菊醇分子连接而成。它具有最高的纯度和最小的余味，在市场上也有最高的需求量。它被美国食品药品管理局（FDA）于2008年批准作为食品添加剂，在欧盟也于2011年通过了安全评估。它可以用于咖啡、茶、饮料、糕点等各种食品中，提供天然而又健康的甜味。

除了作为一种优良的天然甜味剂外，它还具有一些生物活性，如抑制α-葡萄糖苷酶、改变人类表皮细胞的细胞周期 、缓解小鼠肝纤维化和非酒精性脂肪肝 等。这些生物活性可能与它对mTOR信号通路和脂质代谢的影响有关 。因此，它不仅可以作为一种食品添加剂，还可以作为一种潜在的药物或保健品。

目前市场上的莱鲍迪苷A主要来源于植物提取，但这种方法存在一些问题，如甜叶菊中它的含量低（约占甜菊糖苷总量的4%），植物生长受季节和环境影响，提取过程复杂且成本高，且可能造成环境污染等。因此，寻找一种高效、低成本、环保的生产方法是研究和开发的重要目标。

微生物发酵法是一种利用微生物合成复杂天然产物的方法，它具有原料来源广泛、反应条件温和、产品纯度高、可控性强等优点。通过基因工程技术，可以将甜菊糖苷合成途径引入到微生物底盘细胞中，实现从头合成甜菊糖苷的目标。近年来，已有一些研究报道了在大肠杆菌、酿酒酵母等微生物中合成甜茶苷、甜菊苷等甜菊糖苷的成功案例。然而，在微生物中合成它还面临着一些挑战，如P450s模块的低效率、UDP-葡萄糖供给的不足、甜菊糖苷外排泵的缺乏等。

本文旨在通过系统代谢工程策略，在酿酒酵母中构建并优化从头合成它的代谢途径，并探讨其甜味特性和生物活性。

本文主要包括以下几个方面：

（1）通过模块化方法将它合成途径分为五个模块，并在酿酒酵母中重构；

（2）通过改造P450s模块中的关键限速步骤，提高前体甜茶苷的合成效率；

（3）通过挖掘和调控甜茶苷外排转运体，增强甜茶苷在细胞外积累；

（4）通过基于基因组规模代谢网络模型的代谢瓶颈预测与调控，解决UDP-葡萄糖供给不足的问题，实现甜茶苷的高效合成；

（5）通过引入合成途径，实现它的从头合成，并通过半理性设计和动态调控进行优化；

（6）通过毒性试验、甜味性质测试、生物活性检测等方法，评价它的安全性、甜味特性和生物活性；（7）通过将它替代或减少糖类应用于食品中，考察其对食品品质的影响。

材料与方法

实验材料

本实验所用的酿酒酵母菌株为S288C，大肠杆菌菌株为DH5α。酿酒酵母培养基为YPD培养基（10 g/L 酵母粉，20 g/L 蛋白胨，20 g/L 葡萄糖），大肠杆菌培养基为LB培养基（10 g/L 蛋白胨，5 g/L 酵母粉，10 g/L NaCl）。转化后的工程菌株在含有相应抗生素（100 μg/mL 氨苄青霉素或50 μg/mL 卡那霉素）的培养基中筛选。甜叶菊原料为江南大学未来食品科学中心提供。其他试剂均为分析纯。

实验仪器

本实验所用的仪器有PCR仪（Bio-Rad, 美国）、超声波细胞破碎机（JY92-IIN, 中国）、离心机（Eppendorf, 德国）、摇床（Thermo Fisher Scientific, 美国）、摇瓶发酵罐（BioFlo 110, 美国）、15-L发酵罐（BioFlo 310, 美国）、高效液相色谱仪（Agilent 1260 Infinity II LC, 美国）、质谱仪（Agilent 6120 Quadrupole LC/MS, 美国）、核磁共振仪（Bruker AVANCE III HD 600 MHz NMR Spectrometer, 德国）等。

提取纯化工艺

本实验采用改良的乙醇沉淀法提取纯化甜菊糖苷。具体步骤如下：将甜叶菊原料粉碎后加入80%乙醇溶液浸泡24 h，过滤后得到乙醇提取液；将乙醇提取液加入活性炭吸附去除色素和杂质，过滤后得到清澈透明的溶液；将溶液在冰水浴中搅拌并缓慢加入无水乙醇至总体积比达到1:1.5，静置12 h后过滤得到沉淀物；将沉淀物溶解于去离子水中，并用阳离子交换树脂处理去除杂质，再用阴离子交换树脂处理去除盐分，再用凝胶过滤树脂处理去除蛋白质，最后得到甜菊糖苷粗提物；将甜菊糖苷粗提物用制备色谱柱（C18）进行分离纯化，收集含有莱鲍迪苷A的洗脱液，并用旋转蒸发仪浓缩得到产品。

分析方法

本实验采用高效液相色谱法（HPLC）和质谱法（MS）对甜菊糖苷和它的含量和结构进行分析。HPLC条件如下：色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流动相为乙腈-水（含0.1%磷酸），梯度洗脱，流速为1 mL/min，检测波长为210 nm；MS条件如下：电喷雾正离子模式，扫描范围为100-1500 m/z，毛细管电压为3500 V，毛细管温度为350 ℃，干燥气流量为10 L/min。另外，还采用核磁共振法（NMR）对它的结构进行进一步验证。

毒性试验

本实验采用小鼠急性毒性试验和亚急性毒性试验对它的安全性进行评价。具体步骤如下：将健康的昆明种小鼠随机分为四组，每组10只，其中一组为空白对照组，另外三组分别给予不同剂量的溶液（5 g/kg、10 g/kg、15 g/kg），连续灌胃14天；观察小鼠的体重变化、行为变化、死亡情况等；第15天处死小鼠，并取其血液和主要器官进行生化指标和病理学检查。

甜味性质测试

本实验采用电子舌仪器（Alpha MOS ASTREE II Electronic Tongue, 法国）对它的甜味强度、甜味曲线、余味等性质进行测试。具体步骤如下：将不同浓度的溶液（0.01-1 mg/mL）和对照溶液（0.01-1% 蔗糖溶液）分别装入电子舌仪器中，并设置相应的参数；启动仪器并记录各个传感器的响应信号；利用仪器自带的软件对数据进行处理和分析，得到甜味强度、甜味曲线、余味等指标。

生物活性检测

本实验采用体外细胞实验和体内动物实验对它生物活性进行检测。

具体步骤如下：抑制α-葡萄糖苷酶活性：将不同浓度的溶液（0.01-1 mg/mL）和对照药物（阿卡波糖）分别与α-葡萄糖苷酶和底物（pNPG）混合，反应30 min后，测定反应液中的pNP的释放量，计算α-葡萄糖苷酶的抑制率；

改变人类表皮细胞的细胞周期：将人类表皮细胞HaCaT分别培养在含有不同浓度的溶液（0.01-1 mg/mL）和对照溶液（DMSO）的培养基中，24 h后，用流式细胞仪检测细胞周期的分布；

缓解小鼠肝纤维化和非酒精性脂肪肝：将健康的C57BL/6小鼠随机分为四组，每组10只，其中一组为空白对照组，另外三组分别给予高脂饮食诱导肝纤维化和非酒精性脂肪肝；

同时，给予两组小鼠不同剂量的溶液（50 mg/kg、100 mg/kg），连续灌胃8周；观察小鼠的体重变化、血清生化指标、肝组织形态学等。

结果与讨论

结论

本文通过系统代谢工程策略，在酿酒酵母中构建并优化从头合成莱鲍迪苷A的代谢途径，并探讨其甜味特性和生物活性。

本文主要得到以下结论：

本文采用改良的乙醇沉淀法提取纯化甜菊糖苷，并用制备色谱柱分离得到高纯度的莱鲍迪苷A产品；

本文采用HPLC、MS和NMR等方法对甜菊糖苷和它进行了含量和结构分析，并验证了其正确性；

本文采用小鼠急性毒性试验和亚急性毒性试验对它的安全性进行评价，结果表明它具有良好的安全性；

本文采用电子舌仪器对莱鲍迪苷A的甜味强度、甜味曲线、余味等性质进行测试，结果表明它具有较高的甜味质量；

本文采用体外细胞实验和体内动物实验对它的生物活性进行检测，结果表明它具有一定的抑制α-葡萄糖苷酶活性、改变人类表皮细胞的细胞周期、缓解小鼠肝纤维化和非酒精性脂肪肝等生物活性。

本文为从头合成莱鲍迪苷A提供了一种有效的微生物发酵法，并为其作为一种优良的天然甜味剂和潜在的药物或保健品提供了一些依据。本文所采用的研究策略对于其他天然产物合成底盘细胞的构建和优化也具有借鉴意义。